不久前，Nature子刊《Nature Microbiology》（IF 14.3）发表了上海交通大学王风平团队关于烷烃厌氧氧化古菌分布和代谢途径的论文《Expanding anaerobic alkane metabolism in the domain of Archaea》，通过纯数据挖掘发现古菌界的新古菌门类具有烷烃厌氧代谢潜能。
图1 （图片来源：Nature Microbiology）作者挖掘了两大基因组数据库NCBI以及JGI的古菌基因组的数据，因为随着宏基因组分箱工具的快速发展，现在已经可以高精度实现从之前宏基因组（群落的所有基因）数据中提取出某个单菌的基因组，而且这些单菌很多都是未实现纯培养缺乏研究的微生物。甲烷是重要的能源和温室气体，甲烷的产生和氧化消耗是自然界碳循环的最重要环节之一。古菌在甲烷的产生及消耗等过程中发挥着重要作用，烷烃代谢古菌广泛分布在全球不同类型自然环境中，它们每年会产生大约500-600吨的甲烷，而其中有相当大一部分的甲烷会在逸出海底达到海水前被厌氧甲烷氧化古菌（ANME）消耗掉，而通过甲基辅酶M还原酶（MCR）产甲烷和厌氧甲烷氧化是古菌的基本途径之一。在产甲烷菌中，MCR可以将CH3-CoM还原为甲烷（CH4）；而在ANME中，MCR又会将甲烷代谢为CH3-CoM。除了氧化和产生甲烷，MCR还是氧化小分子烷烃丁烷的关键酶。（1）基于MCR代谢烷烃的古菌在环境中分布的规律；（2）这些古菌有哪些新类群，它们的代谢机制是什么；从JGI数据库下载宏基因组的蛋白序列（https://genome.jgi.doe.gov）。为了识别包含基于MCR的烷烃代谢相关基因的宏基因组数据集，使用DIAMOND软件（同一性>30%，覆盖率>75%，e<1×10-20）以本地McrA蛋白质数据库为查询序列，比对包含来自已知产甲烷菌、ANME和多碳烷烃氧化古菌等从NCBI数据库中获取的153个宏基因组的蛋白质序列。从中筛选出64个含有McrA基因的宏基因组数据集，其原始测序读数数据从NCBI sequence read Archive公共数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）下载。使用Sickle算法过滤原始测序，并使用具有MEGAHIT组装过滤后的数据。接着用Prodigal软件进行开放读框（ORF）预测。使用NCBI-nr蛋白质数据库和在线的KEGG服务器GhostKOALA进行ORF注释。基于四核苷酸频率以及丰度信息，使用软件MaxBin以及MetaBAT，对组装的宏基因组序列进行分箱。使用软件CheckM评估基因组质量，将具有最高完整性和最低污染的分箱基因组（MAG）用于进一步分析。然后对所选择的MAG用mmgenome去污染，由compareM计算AAI值。3. 基于保守蛋白、16S rRNA基因和McrABG/DsrA/AprA亚基的系统发育分析：从NCBI原核生物基因组数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/）下载了来自广古菌、TACK、Asgard和DPANN的有代表性的古菌参考基因组。这些参考基因组和来自本研究的MAG被用于构建一组38个标记基因的串联比对，并使用IQ-Tree和RAxML构建系统发育树，自展值为1000。为了进行功能标记基因（mcrA，mcrB，mcrG，dsrA和aprA）和16S rRNA基因的系统发育分析，从MAG检索相应的蛋白质和核苷酸序列，并从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）获得额外参考序列。使用上述相同的程序进行系统发育树构建。
烷烃代谢古菌类群从环境分布角度可以分为5个主要群体，这5个群体组成差异显著，但相互作用较强。同时通过宏基因组数据库分析发现了11个新的烷烃代谢古菌类群，具有烷烃厌氧代谢潜能的古菌广泛分布，除了包括已知的古菌门广古菌（Euryarchaeota）、Bathyarcheaota、Verstraetearchaeota，还包括新古菌门类例如初古菌门（Korarchaeota），Hadesarchaeota、Nezhaarchaeota。其中两支（Nezhaarchaeota）是本研究中新命名的古菌新门类，名字来源于中国神话人物【哪吒】。
图2 基于全基因组及16S rRNA序列的12个古菌MAG的系统发育分析（图片来源：Nature Microbiology）通过新烷烃代谢古菌类群MCR的系统发育分析，提出了关键蛋白MCR的3个新划分的分支，MCR的3个亚基：McrA，McrB，McrG。并且运用综合的烷烃代谢古菌比较基因组分析发现了甲烷厌氧氧化和硫酸盐还原共营养型的代谢模型即同一个细胞完成两种过程，同时提出多个全新的古菌多碳烷烃代谢模型。
图3 12个古菌MAG基于McrA、McrB 及 McrG蛋白序列的系统发育分析。（图片来源：Nature Microbiology）分析发现古丸菌纲（Archaeoglobi）MAG WYZ-LMO1-3包含II组MCR和完全产甲烷途径以及mcr基因，其中两个MAG（WYZLMO1和WYZ-LMO3）还具有编码完全硫酸盐还原途径的基因，包括硫酸腺苷转移酶、腺苷酸硫酸盐还原酶（AprAB）和异化亚硫酸盐还原酶（DsrAB）的基因。来自WYZ-LMO1和WYZ-LMO3的DsrA序列与厚壁菌门（Firmicutes）中的还原型酶的DsrA序列密切相关。许多古丸菌纲可能在这个谱系进化的早期从细菌中获得了dsrAB和aprAB基因，从而获得了进行异化硫酸盐还原的能力。基于基因组信息，作者还发现一些古丸菌纲或许能够在单个细胞中进行硫酸盐依赖的甲烷氧化，具有在一个细胞内同时进行甲烷厌氧氧化和硫酸盐还原的潜能，而目前报道的甲烷厌氧氧化古菌都需要与硫酸盐还原细菌共生。古丸菌纲MAG WYZ-LMO2包含一个完整的Ni-Fe氢酶基因簇，这种酶通常存在于产甲烷菌中，通过消耗氢可以产生还原的铁氧还蛋白和还原的辅酶M（CoMSH），因此古丸菌纲WYZ-LMO2可能是一种具有氢营养型的甲烷菌。作者还发现了一个古丸菌纲MAG JdFR-42，它包含两个高度不同的III组mcr基因集，可能参与多碳烷烃、丙烷和正丁烷的反应。JdFR-42还编码Wood-Ljungdahl途径和脂肪酸氧化途径，包括酰基辅酶A脱氢酶、巴豆酶（FadB1）、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶（FadB2）和乙酰辅酶A乙酰基转移酶（AtoB），古丸菌纲JdFR-42可能是一种新的多碳烷烃降解菌。JdFR-42不携带编码硫酸盐还原酶的基因，但编码硝酸盐还原酶/亚硝酸盐氧化还原酶（NarGHI）、周质硝酸盐还原酶（NAPA）、硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白（NrtP）和固氮酶铁蛋白nifH的基因，因此可能使用硝酸盐/亚硝酸盐作为电子受体。
图4 具有未知mcr基因的MAGs的烷烃代谢模式。（图片来源：NatureMicrobiology）Hadesaxyota的MAG 包含III类mcr基因，这些MAG都有β氧化途径以及Wood-Ljungdahl碳固定途径，但缺乏编码硫酸盐或硝酸盐还原的基因。Nezhaexoxota mags WYZ-LMO7和WYZ-LMO8包含组II mcr基因。这些古菌还编码完整的甲烷生成途径和两种氢化酶，辅酶F420氢化酶（FrhABDG）和铁氧还蛋白依赖性氢化酶（ECH），可能在辅酶F420和铁氧还蛋白循环中起作用。MAG WYZ-LMO7和WYZ-LMO8含有甲酸脱氢酶样基因，其基因组紧邻区域还有Fe-S-簇含有成分的异二硫化物还原酶（HdrABC）。此外，两个hdrD基因位于琥珀酸脱氢酶的基因和含FAD/FMN的脱氢酶基因附近；这些酶一起可用于将异二硫辅酶Bcoenzme M（Cobs-SCoM）还原为还原辅酶M和还原辅酶B。因此，这些Nezhaexexota很可能是氢基因营养的产甲烷菌。Korarchaeota MAG WYZ-LMO9还包含II 组mcr基因及亚硫酸盐还原酶（DsrAB）基因。在编码的DSR酶复合物用于氧化的情况下，在硫化物转化为亚硫酸盐过程中释放的电子可用于从甲基产生甲烷。相反，DSR的还原将接受来自甲烷消耗的电子。MAG WYZ-LMO9缺少甲烷生成途径上游部分的基因，但编码甲基转移酶，这表明它可能使用甲基化化合物生产甲烷。MAG WYZ-LMO9还包含编码用于再生游离CoMSH和CoBSH的HDR复合物的基因，并编码四组潜在的氢化酶。Verstraetearchaeota的MAGWYZ-LMO10和WYZLMO11也包含组II MCR的Imcr基因。它们缺失了产甲烷途径的上游部分，但含有编码mtaA，mtsA和mtmB的基因，表明它们同样是产甲烷菌。MAGS WYZ-LMO10和WYZ-LMO11还包含编码用于再生游离CoMSH和CoBSH的HdrDE复合物的基因，以及用于铁氧还蛋白循环的ECH复合物和能量转换型氢化酶。这些途径的组合可能赋予Verstraetearchaeota甲基营养型产甲烷生长的能力，但需要以分子氢电子供体。编码以MCR为基础的烷烃代谢的基因存在于广古菌、Hadesarchaeota和TACK 超门的不同分支中。MCR复合体三个亚基的系统发育分析表明，广古菌的 MCR序列形成至少三个不同的单系簇。组I和组II的MCR的系统发育与来自系统基因组和16S rRNA基因系统发育分析的拓扑一致。第II组存在广古菌以及古丸菌纲的MCR序列的一种可能性是，Euryachaeota和TACK古菌的共同祖先已经拥有mcr基因簇，该经验簇被垂直遗传到这两个超门中后，这两个超门才开始独立进化，同时古菌古丸菌纲可能通过从TACK古菌的基因横向转移获得了II类mcr基因。第二种可能性是，TACK古菌的祖先在两个超门的分化后可能从古丸菌纲谱系获得了mcr基因。III类的MCRs存在于古菌不同的门中，可能的解释是水平基因转移使得产甲烷或甲烷氧化古菌成为多碳烷烃氧化菌，说明烷烃产生/氧化反应是古菌和早期生命的基本特征。此外MCR与基因组GC含量、四核苷酸频率和密码子使用之间的高度相似性表明，这种水平基因转移应该早在这些有机体的进化中出现。或者由于正向的自然选择作用，产甲烷菌或甲烷氧化菌可能通过MCR的趋同进化而发展出多类型的MCR。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41564-019-0364-2
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